一：基因过表达

（1）原理：将目的基因插入表达载体中，把表达载体转染到目标细胞里，在细胞表达出大量相关目的基因和其编码的蛋白质。

（2）载体：

①哺乳动物载体：转染到人、小鼠等哺乳动物细胞

②原核载体：转染到大肠杆菌等原核生物

③慢病毒载体：HIV、FIV、SIV、EIA

（3）载体构建方法：

①设计与选择：选择目的基因片段、载体

②连接元件：设计合适的引物p出大量目的基因，用酶切/gateway把它们连在一起

③导入目标细胞：通过病毒载体、电穿孔、转染试剂等方法将敲除载体导入到目标细胞中。

二、基因敲低

（1）原理：利用抑制剂，来抑制基因的表达。主要的方式有RNA干扰技术(RNAi),CRISPR-Gas9技术以及gene转染技术。

（2）载体：

①siRNA载体：在3'端有两个碱基的游离,可激活RNA干扰,通过与目标mRNA互补结合序列,特异性地实现靶向mRNA降解。

②shRNA载体：siRNA前体,包括一 个“茎”和一个“环”结构,由RNA序列的短区域(这些区域形成“茎”)之间的碱基配对形成,由不形成碱基对的短序列(形成“环”)隔开。

③CRISPR载体：包含CRISPR靶向序列和转录抑制子。

（3）载体构建方法

①设计干扰序列：采用在线设计工具或经验公式来计算。

②合成和克隆：合成干扰序列的DNA或RNA小片段,并克隆到转录载体中,生成siRNA或shRNA表达载体。

③转化和筛选：将siRNA或shRNA表达载体转化至大肠杆菌中,进行筛选鉴定。

④导入目标细胞：通过病毒等途径将重组质粒导入目标细胞中。

三、基因敲除

（1）原理：用含有一定已知序列的小DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组,整合到受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。

（2）载体：

①CRISPR/Cas9载体：通过Cas9核酸酶和sgRNA靶向序列精确定位并靶向基因DNA序列,然后引入双链断裂点,完成基因敲除。

②TALENs载体：包含特异性核酸酶和nuclease binding domain,通过切割靶向基因DNA序列,完成敲除和编辑。

（3）载体构建方法

①设计和选择：设计基因敲除的靶点,选择CRISPR/Cas9等工具进行编辑。

②载体插入：将编辑过的靶点序列插入到特定的载体中。

③转化和验证：转化编辑好的敲除载体至大肠杆菌中,进行筛选鉴定,验证敲除效果。

④导入目标细胞：通过病毒载体、电穿孔等方法将敲除载体导入到目标细胞中

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